胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）检测试剂盒

胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)检测试剂盒

测定原理：

利用ICDHc催化NADP⁺还原成NADPH反应，在340 nm下测定NADPH浓度的增加。

所需的仪器和用品:

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体50 mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×2支，4℃保存；用时每支加275μL双蒸水充分溶解备用；

试剂三：粉剂ⅹ2支，-20℃保存；用时每支加275μL双蒸水充分溶解备用；

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定操作表：

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1；迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）水浴中，准确反应2分钟；迅速取出比色皿并擦干，记录2分20秒时的吸光度A2。计算ΔA=A2-A1。

注意事项：

1、若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。

2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活；试剂一37℃或25℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

4、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

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