氨基比林-N-去甲基化酶（AND）检测试剂盒

更新时间：2019-11-07

简要描述：

测定意义：
细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。
测定原理：
AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。
氨基比林-N-去甲基化酶（AND）检测试剂盒

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氨基比林-N-去甲基化酶(AND)检测试剂盒

自备仪器和样品：

可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、蒸馏水、无水乙醇和冰。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加100mL蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶（棕色瓶），4℃避光保存。临用前加入1050 μ L无水乙醇，充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入510 μ L蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1瓶，室温保存。临用前加3600μ L蒸馏水，充分溶解。

试剂六：液体×1瓶，室温保存。

试剂七：液体×1瓶，4℃保存。

标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前取1.5 mL EP 管，加入10 μ L标准液，加990 μ L蒸馏水，混匀即为50μmol/L标准甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.2 g组织，加入500μL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液转入超速离心管。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加500μL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二200μL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

测定：

1. 分光光度计预热30 min以上，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min以上。

3. 空白孔：取1支EP管，加入10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入35μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min；取新的EP管，加入100μL上清液，100μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A空白管。每个样品都需要做空白管。

4. 测定孔：取1支EP管，加入10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL试剂四，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入35μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min；取1支新EP管，加入100μL上清液，100μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，加入测定孔，于412nm测定光吸收，记为A测定管。