苯胺-4羟化酶（AH）检测试剂盒

苯胺-4羟化酶(AH)检测试剂盒

测定意义：

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH在P450酶系中相当于CYP2E1亚型，CYP2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。

自备仪器和用品：

酶标仪、普通离心机，低温超速离心机、可调式移液枪、酶标板和冰。

试剂组成和配置：

试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入100 mL蒸馏水，充分溶解。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入10 mL蒸馏水，充分溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2600 μL蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入10 mL蒸馏水，充分溶解。

试剂六：粉剂×1瓶（腐蚀性试剂），4℃避光保存。临用前加入5mL蒸馏水，充分溶解。

试剂七：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5 mL蒸馏水，充分溶解。

标准液：液体×1瓶，10μmol/L，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 除去细胞核和线粒体等：称约0.2 g组织，加入4℃预冷的500 μ L试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2. 粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。

3. 除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加500 μ L试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4. 终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二200 μ L，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。

测定：

1. 酶标仪预热30 min以上，调节波长到630 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三置于37℃水浴中预热30min以上。

3. 试剂五置于冰浴预冷30min以上。

4. 标准孔：在酶标板标准孔中，依次加入100μL 标准液，50μL试剂六，50μL试剂七，混匀后室温静置30min，于630 nm测定光吸收，记为A标准孔。

5. 空白孔：取1支0.5 mL EP管，加入50μL粗酶液，100μL试剂三，50μL蒸馏水，混匀后37℃水浴中保温30min；再加入100μL试剂五，混匀后冰浴5min，11000rpm，4℃，离心10min；在酶标板空白孔中依次加入100μL上清液，50μL试剂六，50μL试剂七，混匀后室温静置30min，于630 nm测定光吸收，记为A空白管。

6. 测定孔：取1支0.5 mL EP管，加入50μL粗酶液，100μL试剂三，50μL试剂四，混匀后37℃水浴中保温30min；再加入100μL试剂五，混匀后冰浴5min，11000rpm，4℃，离心10min；在酶标板空白孔中依次加入100μL上清液，50μL试剂六，50μL试剂七，混匀后室温静置30min，于630 nm测定光吸收，记为A空白管。

苯胺-4羟化酶(AH)检测试剂盒