更新时间:2019-11-07
测定意义:Na+K+- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中,可催化ATP水解生成ADP和无机磷。测定原理:Na+K+-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷,通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性。Ca++Mg++——ATP酶检测试剂盒
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Ca++Mg++——ATP酶检测试剂盒
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体50mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体 5ml×1 瓶,4℃保存。
试剂四:粉剂×3 支,-20℃保存。用时每支加1mL蒸馏水,现用现配。用不完的试剂-20℃可保存一周。
试剂五:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。
试剂六:粉剂×1 瓶,4℃保存。用时加入3mL双蒸水, 4℃保存。
试剂七:粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL双蒸水,溶解后4℃保存一周。
试剂八:粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL双蒸水,溶解后4℃保存一周。
试剂九: 液体 25mL×1 瓶,室温保存。
试剂十:10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4℃保存。
0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将贮备液 20倍稀释,即取 0.1mL试剂十加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制:按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。
样品酶液的制备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约0.1g组织,加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
操作步骤
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。
2、酶促反应(在EP管中加入下列试剂)
| 对照管 | 测定管 |
试剂一(μL) | 130 | 90 |
试剂二(μL) | 40 | 40 |
试剂三(μL) | 40 | 40 |
试剂四(μL) | 40 | 40 |
试剂五(μL) |
| 40 |
样品 (μL) |
| 200 |
混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴10min
试剂六(μL) | 50 | 50 |
样品(μL) | 200 |
|
混匀,4000g,常温离心10min,取上清液
3定磷(在1.5mLEP管中依次加入下列试剂)
| 空白管 | 标准管 | A管 | B管 |
0.5μmol/ml标准磷应用液(μL) |
| 100 |
|
|
上清液(μL) |
|
| 100 | 100 |
蒸馏水(μL) | 100 |
|
|
|
定磷试剂(μL) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混匀,37℃水浴 30 min,冷却至室温,在 660nm处比色。
注意:
1、A管为对照管;B管为Na+K+-ATP酶测定管;
2、由于每一个样都必须做对照,本试剂盒50管保证测 24份Na+K+-ATP酶。
3、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。
4、空白管和标准管只要做一管。
计算
1、血清(浆)Na+K+- ATPase活力的计算:
定义:规定每小时每毫升血清(浆)中Na+K+- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(U/mL)= C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷V样÷T=7.5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
组织中Na+K+- ATPase的计算:
2、组织、细菌或细胞中Na+K+- ATPase活力的计算:
(1)按蛋白浓度计算:
定义:规定每小时每毫克组织蛋白中Na+K+- ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(U/mg)= C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(Cpr×V样)÷T =7.5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
定义:规定每小时每克组织中Na+K+-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(U/g)= C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(V样÷V样总×W)÷T=7.5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
定义:规定每小时每1万个细菌或细胞中Na+K+-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Na+K+-ATP酶活力(U/104)= C标准管×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V总÷(V样÷V样总×500)÷T=0.015×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)
C标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V总:酶促反应总体积,0.5mL;V样:加入样本体积,0.2mL ;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1/6小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500万。
Ca++Mg++——ATP酶检测试剂盒