更新时间:2019-11-07
测定意义TH位于线粒体的内膜上,又称为线粒体复合体六,催化NADH+NADP+和NAD++NADPH相互转化,调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2,催化NADPH和NAD+生成NADP+和NADH。转氢酶-2检测试剂盒
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转氢酶-2检测试剂盒
测定原理
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代NAD+,TH-2催化APAD+还原生成APADH,APADH在375nm有特征光吸收,测定375nm光吸收的增加速率,来计算TH-2活性。
需自备的仪器和用品
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一:液体50mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:液体25mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:液体25mL×2瓶,4℃保存;
试剂四:粉剂×2支,-20℃保存;
试剂五:粉剂×2支,-20℃保存;
工作液的配制:临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支,将试剂四、五转移到1瓶试剂三中混合溶解。这样可以分两批配制工作液,防止工作液失效。
转氢酶-2的提取
测定步骤:
用蒸馏水于375nm处调零。
(1)取1mL工作液加入1mL玻璃比色皿,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
(2)取出比色皿,加入100μL样本,混匀;立即记录375nm处初始吸光值A1,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中准确反应10min,记录375nm处10min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
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