转氢酶-1检测试剂盒

转氢酶-1检测试剂盒

测定原理

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP⁺）替代NADP⁺，TH-1催化 APADP⁺还原生成的APADPH在375nm有特征光吸收，因此通过测定375nm光吸收增加速率，来计算TH-1活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：液体50mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体25mL×2瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×2支，-20℃保存；

试剂五：粉剂×2支，-20℃保存；

工作液的配制：临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支，将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解。这样可以根据需要分两批配制工作液，防止工作液失效。

TH-1的提取

• 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL试剂一，用冰浴匀浆。
• 4 ℃ 600 g离心5min。
• 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心10min。
• 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的TH-1（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
• 在沉淀中加入500uL试剂二，超声波破碎（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于TH-1活性和蛋白含量测定，蛋白质含量测定需要另外购买相应的试剂盒。

测定步骤：

1. 调零

用蒸馏水于375nm处调零。

1. 样本测定

（1）取1mL工作液加入1mL玻璃比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2）取出比色皿，加入100μL试样本，混匀；立即记录375nm处初始吸光值A1，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应10min，记录375nm处10min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

转氢酶-1检测试剂盒