更新时间:2019-11-07
测定意义:NP在一定的温度和中性pH条件下,催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点,中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。测定原理:中性条件下,NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在680nm有特征吸收峰。中性蛋白酶检测试剂盒
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中性蛋白酶检测试剂盒
自备仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP管和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:液体×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加4mL蒸馏水溶解。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入4mL试剂一,沸水浴中磁力搅拌溶解。
试剂四:粉剂×1瓶, 4℃保存。临用前加20mL蒸馏水溶解。
试剂五:液体×1瓶,4℃保存。
标准品:液体×1支,0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液,4℃保存。
粗酶液提取:
称约0.1g组织,加入1ml试剂一,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心10min,取上清,即粗酶液。
测定:
1.分光光度计预热30min以上,调节波长到680 nm,蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min以上。
3. 空白管:取0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL试剂二,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入40μL试剂三,混匀后10000rpm 4℃离心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm测定光吸收,记为A空白管。
4. 测定管:取0.5 mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL试剂三,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入40μL试剂二,混匀后10000rpm 4℃离心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm测定光吸收,记为A测定管。(注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二)
5. 标准管:取0.5 mL EP管,加入40μL标准品,200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm测定光吸收,记为A标准管。
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