线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒

线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒

测定原理

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1 mL×1瓶，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1.3mL双蒸水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂五：6mL×1瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL双蒸水，充分混匀;

试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL双蒸水，充分混匀;

试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL双蒸水，充分混匀;

试剂九：液体10mL×1 瓶，室温保存。

定磷试剂的配制：按H₂O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

复合体Ⅴ的提取

• 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
• 4 ℃ 600 g离心5min。
• 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心10min。
• 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
• 在沉淀中加入800uL试剂二和8uL 试剂三，超声波破碎（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

测定步骤

1、酶促反应

混匀， 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确水浴30min

混匀，4000g，室温离心10min，取上清液

2、定磷

混匀，室温静置10min左右，在 660nm处用对照管调零，读取测定管吸光值

线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒