碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒(抑制敏感法)的产品组成

 碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒(抑制敏感法)的产品组成

产品简介：

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称 ALP 或 AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适 pH 9.2~9.8，碱性磷酸酶同工酶有肝、骨、小肠、胎盘、

胆汁等同工酶。碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒(抑制敏感法)采用磷酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游离酚和磷酸，在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成红色醌式结构物，呈深浅不一的红色，产物红色越深说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过比色法(分光光度计或酶标仪)测定 510nm 处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出总的碱性磷酸酶活性水平；同时通过尿

素、苯丙氨酸抑制后测定残余 ALP 活性，以确定同工酶的性质，可用于检测细胞或组织的

裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸酶同工酶活性；如果用分光光度计，100T 的检测试剂盒可检测 33 次左右；如果用酶标仪，100T 的检测试剂盒可检测 330 次左右。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

自备材料：

1、离心管或 96 孔板、水浴锅或恒温箱、分光光度计或酶标仪

2、ddH2O 、PBS 或生理盐水

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品：

①细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理盐水进行适当匀浆，一般细胞数量在 106 以上，组织应在 100mg 以上，3000~4000rpm 离心取上清，-20℃冻存，用于碱性磷酸酶同工酶的检测。

②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。

③高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或 PBS等进行稀释，如鸡血清、血浆可稀释 5～10 倍后检测。

2、配制 ALP 显色试剂：临用前将 ALP 显色试剂 A 和 ALP 显色试剂 B 按 1:2 比例混合即可，不宜长期保存。

3、配制标准品工作液：取出 Phenol 标准(1mg/ml)恢复至室温后，取 0.1ml 溶解于 1.9ml ddH2O，即为 Phenol 标准(0.05mg/ml)，按照下表稀释系列标准品溶液。

4、分光光度计测定(检测总 ALP)：按照下表设置对照管、标准管、尿素测定管、苯丙测定

管、总 ALP 测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的碱性磷酸酶同工酶的活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管以 0 号管(ddH2O)调零，比色杯光径 1cm，以分光光度计测定对照管、标准管、尿素测定管、苯丙测定管、总 ALP 测定管 510nm 处吸光度(即 A 对照、A 标准、A 测定)。如无法检测 510nm，亦可检测 500～530nm 范围内吸光度，一般应 15min 内检测完毕。

5、酶标仪测定(检测总 ALP)：按照下表设置对照孔、标准孔、尿素测定孔、苯丙测定孔、 总 ALP 测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的碱性磷酸酯酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行孔。

计算：碱性磷酸酶金氏活性单位的定义：在 37℃条件下，100ml 待测样品与显色底物(即

磷酸苯二钠)作用 15min，产生 1mg 酚为一个金氏单位(U/L)。

以系列 Phenol 标准(1～6 号管)对应的金氏单位为横坐标，以相应的 A 标准(1～6 号管)

为纵坐标，绘制标准曲线(亦可分别制作标准曲线)。以(A 测定-A 对照)之差值为实际的吸光度，

用该差值与标准曲线进行对比，求出总 ALP、 尿素抑制 ALP、苯丙抑制 ALP 活性单位。

尿素抑制 ALP 残余活性百分率=尿素抑制 ALP 残余活性/总 ALP 活性×100%

苯丙抑制 ALP 残余活性百分率=苯丙抑制 ALP 残余活性/总 ALP 活性×100%

注意事项：

1、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、 如果没有分光光度计，也可以使用酶标仪测定，但应注意 96 孔板最大检测体积，推荐采用分光光度计检测。

3、 所测样品的值高于标准曲线的上限，应稀释样品后重新测定。

4、 如果空白管/孔显红色，说明 ALP 显色液不可用，应丢弃。

5、 加入显色基液时应迅速，并且及时混匀，否则显色不充分。

6、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6 个月有效。常温运输，4℃保存。

 碱性磷酸酶同工酶检测试剂盒(抑制敏感法)的产品组成