线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测试剂盒

线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测试剂盒

测定原理

复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：5mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：0.5 mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂七：液体2.5mL×1瓶，4℃保存；

工作液的配制：临用前依次把试剂五和试剂六转移到试剂四中混合溶解。

复合体Ⅱ的提取：

1. 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2. 4 ℃ 600 g离心5min。
3. 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心10min。
4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做）。
5. 在沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅱ酶活性测定。

测定步骤：

1. 调零

用蒸馏水于605nm处调零。

1. 样本测定

（1）取40μL酶液和800μL工作液加入1mL玻璃比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2）取出比色皿，加入100μL试剂七，混匀；立即记录605nm处初始吸光值A1，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录605nm处2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测试剂盒