线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）检测试剂盒

线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)检测试剂盒

测定原理

ICDHm催化NAD⁺ 还原生成NADH，导致340nm处光吸收上升。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1支，4℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂七：粉剂×1支，-20℃保存; 临用前加入3mL双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃保存。

工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六转移到试剂四中混合溶解待用。

ICDHm的提取

1. 准确称取约0.1g组织或收集约500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵研磨。
2. 4 ℃ 600 g离心5min。
3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心10min。
4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定可能从线粒体泄漏的ICDHm（此步可选做）。
5. 在沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体ICDHm活性测定。

测定步骤

1. 调零

用蒸馏水于340nm处调零。

1）取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2）取出比色皿，再依次加入60μL试剂七和80μL样本，混匀；加入样本的同时开始计时，立即记录340nm处20s的吸光值A1，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min20s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项

1、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)检测试剂盒