丙酮酸激酶（PK）检测试剂盒

丙酮酸激酶(PK)检测试剂盒

测定意义

PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液：60mL×1瓶，4℃保存;

试剂一：液体45mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入1.5mL双蒸水充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂四：液体×1支，4℃保存；临用前每支加入900μL双蒸水充分溶解备用，用不完的试剂仍4℃保存;

PK工作液的配制：临用前将试剂二转移至试剂一中，充分溶解待用。

样本的前处理

1、细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，工作3s，间歇10s，工作35次），8000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；8000g ，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm下比色，记录2分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

注意事项

1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

丙酮酸激酶(PK)检测试剂盒