HRP标记兔抗人IgA

标题：HRP标记兔抗人IgA

产品概述

HRP标记兔抗人IgA

本产品仅用于研究用途，不用于人类、治疗或诊断应用。

辣根过氧化物酶(HRP)标记

(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基,加入抗体lgG后该醛基与lgG氨基结合,形成Sch氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合,在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了,用朋氢化钠稳定Schf氏碱。这里介绍两种程序。

程序一

(1)将5 mg HRP溶于0.5m0.1 mol/L NaHCO3溶液中 加 0.5ml  10mmoLNaO4溶液,混勻,盖紧瓶塞,室温避光作用2小时。

(2)加075m0. mol/L Na2CO3混勻。

(3)加入0.75m小風已处理的腹水,或纯化单抗等(15mgm),混勻。

(4)称取 Sephadex  G25干粉0.3g 加入一支下口垫玻璃棉的5m注射器外筒内;随后籽上述交联物移入注射器外套;盖紧,室温作用(避光)3小时或4°C过夜。

HRP标记兔抗人IgA
(5)用少许PBS将交联物全部洗出,收集洗出液,加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml

NaBH4溶液,混勻,室温作用30分钟;再加入320 V NaBH4溶液,混勻,室温作用1小时或4过夜)

(6)将交联物过 Sephadex g200或 Sepharose6B(2.6×50cm层析纯化,分管收集第Ⅰ 峰。(7)酶结合物质量鉴定

克分子比值测定 酶量(mg/m)=OD403  ×0.4

IgG量(mg/m)=(OD280OD403×0.3)×062克分子比值(EP=酶量×4/gG量,一般在12之间。

酶结合率=酶量x体积/抗体,标记率一般为03-0.6,即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子,标记率可大于06,080.90D4030D280等于04时,EP约为1

标记率=OD4030D280

酶活性和抗体活性的测定可应用E凵SA法、免疫扩散

DABH2O2显色反应测定酶结合物的酶活性,抗体活性及效

 价、特异性。

(8)HRP抗体结合物的保存:加入等量甘油后,小量分装-20°℃存放,防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐,否则会影响酶活性。必要时冻干保存,以BSA或脱脂牛奶作保护剂。

程序二:

(1)将5 mg HRP溶于0.3 mol/L PH8.1NaHCO3溶液中,加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml室温搅拌作用1小时,以封闭HRP分子上的a和ε氨基。(2)再加1ml 0.06moL过碘酸钠溶液,在室温中避光轻搅30分钟,溶液呈黄绿色:随后加1ml 0.06moL 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。

(3)移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/LPH9.5碳酸盐缓冲液中，4°C透析过夜，更换三次缓冲液，
注意避光。
(4)吸取上述醛化好的HRP溶液3ml,加入5mgIgG的碳酸盐缓冲液1ml,室温轻搅2-3小时，避光;加入5mg NaBH4 4°C放置3小时或过夜，或换用乙醇胺(2mol/L
PH9.5)0.2ml，作用| 7小时。(5)再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析
24小时，更换三次缓冲液。 

单体IgA占血清免疫球蛋白的5-15%，而二聚IgA则局限于粘膜表面，如唾液、胃肠道分泌物、支气管液和牛奶。粘膜IgA通过中和粘膜表面的感染因子，在宿主防御中发挥重要作用。这种产生通常是局部的，抗原特异性IgA产生的B细胞可以在固有层下的区域找到，在那里成熟为产生二聚IgA的浆细胞。IgA缺乏是常见的免疫缺陷，可能影响血清和粘膜产生的IgA。