MMP2/9活性含量检测服务

MMP2是位于16号染色体的基因。
MMP-9基因位于染色体20q11.1~13.1，26~27kbp，具有13个外显子和9个内含子，属于基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein,MMP ）家族。主要功能是降解和重塑细胞外基质（extracellular matris）的动态平衡。

作用功能
该基因是基质金属蛋白酶(MMP)基因家族的成员，是一种锌依赖的酶，能够切割细胞外基质的成分和参与信号转导的分子。该基因编码的蛋白是明胶酶A，IV型胶原酶，其催化位点中含有三个纤维连接蛋白II型重复序列，使变性IV型胶原和V型胶原与弹性蛋白结合。与大多数MMP家族成员不同，这种蛋白的激活可以发生在细胞膜上。这种酶可以被蛋白酶细胞外激活，也可以被S-谷胱甘肽化而被胞内激活，而不需要蛋白质溶出的前区。该蛋白被认为参与多种途径，包括作用于神经系统，子宫内膜月经破裂，调节血管化，和转移。该基因突变与Winchester综合征和结节病-关节病-骨溶解综合征(NAO)有关。选择性剪接会导致编码不同异构体的多个转录体变异。

检测步骤：
1. 制备含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDSPAGE
凝胶。将10 × substrate G 融化，并90 ?C 加热5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加
入10 × substrate G 并使之稀释10 倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。
2. 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM
Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅
使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。阳
性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing
buffer 等体积混合，取5-15μl 上样。
3. 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4. 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml
1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。
5. 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37?C 孵育1~5 小时。阳性
对照或者血中的MMP 通常37?C 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低，应延长孵育时间为
10 小时或过一夜。
6. 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见SDS-PAGE
凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置
不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及
活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa
位置出现透明条带。
7. 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP 条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决
办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。
MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。