6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）检测试剂盒

6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)检测试剂盒

测定原理：

G6PDH催化NADP⁺还原生成NADPH，在340 nm下测定NADPH增加速率。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体50 mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1，-20℃保存；用时每支加275μL双蒸水充分溶解备用； 

试剂三：粉剂×1，-20℃保存；用时每只加275μL双蒸水充分溶解备用。

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备 ：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

G6PDH测定操作表：

测定前将试剂一置于37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）水浴中预热10min左右，将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，加样本的同时开始计时；混匀，在34 0 nm波长下记录1min时的初始吸光度A1，迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）水浴中，准确反应5min；迅速取出比色皿并擦干，记录6min时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：

1、若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。

2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

4、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

G6PDH活力单位的计算：

1、血清（浆）G6PDH活力的计算:

单位的定义：每升血清（浆）在反应体系中每分钟生成1 μmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/L）＝反应总体积（800μL）÷样本体积（30μL）÷反应时间(5min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA =857×ΔA

2、组织中G6PDH活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/mg prot）＝反应总体积（800μL）÷样本体积（30μL）÷反应时间(5min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA ÷蛋白质浓度（mg/mL）=857×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/g 鲜重）＝反应总体积（800μL）÷样本体积（30μL）÷反应时间(5min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA÷样品鲜重（g/mL）=857×ΔA÷样品鲜重（g/mL）

3、细菌或细胞中G6PDH活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/mg prot）＝反应总体积（800μL）÷样本体积（30μL）÷反应时间(5min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA ÷蛋白质浓度（mg/mL）=857×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

G6PDH（U/10⁴ cell）＝反应总体积（800μL）÷样本体积（30μL）÷反应时间(5min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA ÷细菌或细胞密度（10⁴个/mL）=857×ΔA÷细菌或细胞密度（10⁴个/mL）

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