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手把手教您使用乳酸脱氢酶(LDH)测试盒

更新时间:2023-03-02      浏览次数:122

手把手教您使用乳酸脱氢酶(LDH)测试盒


测定意义: LDH(EC 1.1.1.27)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是糖酵解途径的末端酶,催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应,伴随着 NAD+ /NADH 之间互变。测定原理: LDH 催化 NAD+氧化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸进一步与 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中显棕红色,颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。需自备的仪器和用品:可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。


样品测定的准备: 1、细菌、细胞或组织样品的制备:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 1000~5000:1 的比例(建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 2、血清(浆)样品:直接检测。 


使用 96 孔板测定的计算公式如下: 1、标准条件下测定的回归曲线, y = 0.4554x+0.0037 (x 为标准品浓度,umol/mL;y 为 ΔA)。 2、血清(浆)LDH 活力的计算单位的定义:每 mL 血清(浆)每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0037)÷0.4554÷T×103 =146.4×(ΔA-0.0037) 3、细胞、细菌和组织中 LDH 活力的计算(1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH(nmol/min/mg prot)=([ ΔA-0.0037)÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =146.4×(ΔA-0.0037) ÷Cpr 需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。(2) 按样本鲜重计算:单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH ( nmol/min/g 鲜 重 ) =[ ( ΔA-0.0037 ) ÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =146.4× (ΔA-0.0037)÷W (3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH(nmol/min/104 cell)= [(ΔA-0.0037)÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.073× (ΔA-0.0037)V1:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V2:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,15 min; Cpr:蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细胞或细菌总数,2000 万;103:1umol/mL=103 nmol/mL。 


1、 标准曲线线性范围为:0.1 umol/mL -2 umol/mL。 

2、 ΔA 线性范围为:0.01 -1。


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