PCR反应出现假阳性是什么原因造成的，你知道吗

PCR反应出现假阳性是什么原因造成的，你知道吗

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1976年，中国科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶适合反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

引物设计的基本原则

1.引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
2.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带ATGC随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
3.引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
4.引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能*互补序列，否则易导致非特异性扩增。
5.引物3‘端的碱基，特别是罪末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，选择是G和C。
6.引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、第高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

当PCR反应出现假阳性是什么原因，如下：

1) 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

2) 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

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