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亿迅生物-实时荧光定量PCR实验科普,快来围观

更新时间:2020-07-21      浏览次数:342

亿迅生物-实时荧光定量PCR实验科普,快来围观

 

技术简介:

实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·

Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

 

技术应用:

1 核酸定量分析:对传染性疾病进行定量定性分析,病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型H1N1流感, 转基因动植物基因拷贝数的检测,RNAi 基因失活率的检测等。

2 基因表达差异分析: 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ,特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。

3 SNP 检测:检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义,因分子信标结构的巧妙性,一旦SNP 的序列信息是已知的,采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。

4 甲基化检测:甲基化同人类的许多疾病有关,特别是癌症, Laird 报道了一种称作 Methylight的技术,在扩增之前先处理 DNA ,使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受影响,用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ,这种方法不仅方便而且灵敏度更高。

 

正确分析结果:

1、如果有标准曲线,按照标bai准曲线计算;

2、一般都是相对量,则zhi用delta delta CT方法来计算;

3、引物或探dao针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性;

4、模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的高浓度做起;

5、看CT值是分析荧光定量PCR较直观的一个数据,CT值一般在35左右就失去参考价值了,平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。

 

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

 

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