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BBT缓冲液(pH8.6)

更新时间:2022-02-09

简要描述:

BBT缓冲液(pH8.6)专门应用于电泳相关实验,例如琼脂糖凝胶电泳实验,醋酸纤维素膜电泳实验,检测血清蛋白等电点等等相关实验

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BBT缓冲液(pH8.6)

使用举例:用于白蛋白(或丙种球蛋白)纯度测定

(醋酸纤维素薄膜电泳法)

1试剂

1.1 BBT缓冲液(Ph8.6)

1.20.5%氨基黑染色液

取氨基黑10B0.5g,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及蒸馏水40ml的混合液中。

1.3漂洗液

取乙醇45ml,冰醋酸5ml及蒸馏水50ml,混匀。

1.40.2mol /L氢氧化钠

取8g氢氧化钠,加蒸馏水溶解成1000ml。

1.5透明液

取冰醋酸25ml,加无水乙醇75ml,混匀。

2 操作

2.1电泳

将膜条(2×8cm)粗糙面向下,浸入BBT缓冲液中,待*浸透,取出用滤纸吸去多余的缓冲液,将膜条粗糙面向上,加于电泳支架上的滤纸桥上(或桥下),于膜上距负极一端2cm处,直线状滴加蛋白质含量约5%的样品2~3μl,通电,电流控制在0.4~0.6mA/cm[总电流量=生产要膜的宽度(cm)×膜条数],同时取新鲜人血清作对照,电泳时间以白蛋白与丙种球蛋白之间的电泳展开距离达3~4cm为宜。

2.2 染色

电泳完毕,将膜条取下浸于染色液中,2~3分钟后,用漂洗液反复漂洗至底色*脱净。

2.3 透明

将漂净并*干后的膜条浸于透明液至全部浸透为止,取出平铺于洁净的玻璃板上,干后即成透明薄膜,可供扫描法测定样品纯度和作为标本长期保存用。

2.4 纯度测定

2.4.1 洗脱法:将漂洗净的膜条用滤纸吸干,与正常人血清的电泳图谱作对照,剪下白(或丙种球蛋白)带A及其他杂蛋白质区带B,分别浸于5ml0.2mol/L氢氧化钠溶液中,振摇数次,至色泽*浸出后,于620nm波长下测其OD值,以相同条件下,无蛋白质部分的膜条(其长度分别同A及B)作空白对照。

样品中白蛋白(或丙种球蛋白)含量%=A的OD值-A空白的OD值/(A的OD值-A空白的OD值)+(B的OD值-B空白的OD值)×100%

2.4.2 扫描法:将干燥的样品醋酸纤维素薄膜电泳图谱放入自动光密度扫描仪,通过反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式测定各蛋白质电泳区带的OD值,根据仪器性能,可自动或手工方法计算出样品白蛋白(或丙种球蛋白)的百分含量。

附注

用扫描法测定白蛋白(或丙种球蛋白)纯度时,可采用丽春红染色法,其染色液及漂洗液配方如下:

0.2%红染色液:

取丽春红0.2g,磺基水杨酸3g及三氯醋酸3g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml。

漂洗液:

取冰醋酸3ml,用蒸馏水稀释至100ml。

BBT缓冲液(pH8.6)

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