更新时间:2019-11-07
测定意义α-KGDH(EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调控关键酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。测定原理α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、 二氧化碳和 NADH,NADH在340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)检测试剂盒
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α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)检测试剂盒
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一:50mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:10mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:1mL×1支,-20℃保存;
试剂四:液体55.5mL×1瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1支,4℃保存;
试剂六:粉剂×1支,4℃保存;
试剂七:粉剂×1支,4℃保存;
试剂八:粉剂×1支,4℃保存;
试剂九:粉剂×1支,-20℃保存;
试剂十:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加入2.1mL双蒸水充分混匀待用,用不完的试剂仍-20℃保存。
工作液的配制:临用前把试剂五、试剂六、试剂七、试剂八和试剂九转移到试剂四中混合溶解待用。
α-KGDH的提取
测定步骤
用蒸馏水于340nm处调零。
1)取1.1mL工作液加入1mL石英比色皿,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
2)取出比色皿,再依次加入40μL试剂十和60μL样本,混匀;加入样本的同时开始计时,立即记录340nm处20s的吸光值A1,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中准确反应2min,记录340nm处2min20s时的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
注意事项
1、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置,以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)检测试剂盒