NAD-苹果酸酶（NAD-ME）检测试剂盒

NAD-苹果酸酶(NAD-ME)检测试剂盒

测定意义：

ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO₂，以及伴随NAD(P)⁺的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存。；

试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体20mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×2支，4℃保存；用时每支加1mL双蒸水充分溶解备用；

试剂四：粉剂×2支，-20℃保存；用时每支加500μL双蒸水充分溶解备用。

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备 ：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定操作表：

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，混匀后在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种），340 nm波长下记录初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：

1、若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。

2、实验时，试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

4、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

NAD-苹果酸酶(NAD-ME)检测试剂盒