NADP磷酸酶（NADPase）检测试剂盒

NADP磷酸酶(NADPase)检测试剂盒

所需的仪器和用品：

可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体30 mL×1瓶， 4℃保存。

试剂二：粉剂×6支，-20℃保存；用时加入1 mL试剂一充分溶解备用，现配现用。

试剂三：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL双蒸水，溶解后4℃可保存一周。

试剂四：粉剂×1瓶, 4℃保存。用时加入25mL双蒸水，溶解后4℃可保存一周。

试剂五：液体 25mL×1 瓶，室温保存。

试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂六20倍稀释，即取 0.5mL试剂六加9.5蒸馏水，充分混匀1。

定磷试剂的配制：按H₂O: 试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂

              应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。

注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

样本的前处理：

称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

操作步骤：

1、酶促反应

37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热5min

37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20min后，沸水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g常温离心5min，取上清

2、定磷

混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴30min，冷却至室温，在 660nm处，蒸馏水调零，记录各管吸光值

注意事项：

1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，后用蒸馏水冲干净。用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。

2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。

NADP磷酸酶(NADPase)检测试剂盒