二抗必须能识别一抗。如果一抗是小鼠单克隆抗体，分离类型是小鼠IgG1，那么二抗必须选择抗小鼠IgG的抗体；同样，如果一抗来源于山羊，二抗必须选择抗山羊的抗体。 Alexa Fluor 647标记的兔抗鸡IgG

虽然可购买能识别所有亚类的一般的抗小鼠IgG二抗，但尽可能购买抗某一特定亚类的抗体以增加特异性。大多数物种的分离类型都是IgG，物种特异性抗IgG抗体能很好地工作。但注意鸟类或禽类的免疫球蛋白为IgY。 PE-Cy7标记的兔抗鸡IgM

购买二抗时注意分别选择抗小鼠IgM和小鼠IgG的抗体。 小鼠IgG抗体还可以分为各种亚类，如IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG2c，IgG3。 PE-Cy5.5标记的兔抗鸡IgM

二抗还必须对应一抗的类和亚类。尤其是一抗是均质的单克隆抗体时，这点 特别重要。例如，一些一抗分离类型是小鼠IgM，而有一些是IgG。IgM通常占血清免疫球蛋白的10%。IgM抗体在大多数抗原的早期免疫反应中起着重要的作用，由于其体积较大，很大程度上局限于血浆中。 Alexa Fluor 647标记的兔抗鸡IgM

预吸附（又称交叉吸附）是为提高抗体特异性而引入的额外步骤，具体方法是利用具有潜在交叉反应性的物种）制备固定血清蛋白，然后使二抗混合物（例如含有抗兔 IgG 轻链、抗绵羊 IgG 轻链和抗牛 IgG 轻链的二抗）通过含有这种固定血清蛋白的基质。IgM通常占血清免疫球蛋白的10%。IgM抗体在大多数抗原的早期免疫反应中起着重要的作用。 Alexa Fluor 555标记的兔抗鸡IgM

如今的设计一般是二抗带上可检测标记，再来检测一抗。而一抗识别底物。这样，当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。 Alexa Fluor 488标记的兔抗鸡IgM