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大鼠环磷酸腺苷(cAMP)酶联免疫试剂盒实验原理

更新时间:2023-07-05      浏览次数:109

大鼠环磷酸腺苷(cAMP)酶联免疫试剂盒实验原理


本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠环磷酸腺苷(cAMP)水平。用纯化的大鼠环

磷酸腺苷(cAMP)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入环磷酸腺

苷(cAMP),再与HRP 标记的环磷酸腺苷(cAMP)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,

经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下

转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的环磷酸腺苷(cAMP)呈正相关。用酶标仪在450nm

波长下测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计算样品中大鼠环磷酸腺苷(cAMP)浓度。

标本要求

1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能

马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融

2.不能检测含NaN3 的样品,因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

操作步骤

1. 标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀

释。

600pg/ml 5 号标准品150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液

300pg/ml 4 号标准品150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液

150pg/ml 3 号标准品150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液

75pg/ml 2 号标准品150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液

37.5pg/ml 1 号标准品150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液

2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、

待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,

然后再加待测样品10μl(样品*终稀释度为5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽

量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。

4. 配液:将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用

5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此

重复5 次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

7. 温育:操作同3。

8. 洗涤:操作同5。

9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色

15 分钟.

10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11. 测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。测定应在加终止

液后15 分钟以内进行。

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