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标题：《RNA甲基化因子对肾透明细胞癌预后价值的探讨和验证》

摘要：【目的】肾透明细胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma ccRCC)是高发的一类恶性肿瘤,罹患率和死亡率居高不下,因此研究ccRCC的致病机制,寻找新的分子治疗靶向位点是十分必要的。RNA甲基化是重要的转录后修饰方法,既往研究已发现多个RNA甲基化调节因子与恶性肿瘤密切相关,但全面探讨RNA甲基化因子对ccRCC临床病理影响的报道相对较少,因此本课题应用生物信息学分析开展RNA甲基化调控因子与ccRCC关系的研究,进而用细胞和组织实验对生信结果进行验证。【方法】1、从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库的ccRCC全基因表达谱中提取48个RNA甲基化调控因子的表达队列,从中筛选差异表达基因;对差异表达基因进行功能注释;利用单因素cox分析筛选与ccRCC预后相关的差异表达基因。2、用R包“Consensus Cluster Plus"对预后相关的差异表达基因进行无监督聚类分型,分析不同分型ccRCC的预后情况,在分型中进行富集分析,比较不同分型中免疫微环境的差异。3、用“glmnet"包中的Lasso cox方法,基于有预后价值的RNA甲基化因子构建ccRCC的风险评分模型,结合风险评分建立列线图以量化风险评分的预后能力。4、结合多因素cox分析和文献检索筛选出进一步分析的一个关键因子。5、利用RNA定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)实验和Western Blot(蛋白质印迹法)检测ccRCC细胞株中关键因子的mRNA和蛋白表达情况。6、利用RT-qPCR实验分析目的基因在新鲜ccRCC组织和癌旁肾组织中的mRNA表达情况。7、随机选取ccRCC石蜡组织进行免疫荧光实验,明确目的蛋白在癌和正常组织中的表达模式。选取我院2014年-2018年经病理科确诊的80例ccRCC石蜡标本,进行关键因子的石蜡组织免疫组化实验,比较目的蛋白在癌组织和正常肾组织中的表达差异。8、联合80例ccRCC石蜡组织中目的蛋白的免疫组化结果和肿瘤发病部位、肿瘤直径、性别、年龄、有无脉管内癌栓、肿瘤ISUP分级、肿瘤分期、Ki-67指数等临床病理参数进行相关性分析;探究目的蛋白对ccRCC生存预后的影响,结合临床病理参数进行单因素和多因素cox分析,最后联合临床参数构建预后列线图模型。【结果】1、纳入的48个RNA甲基化调节因子在ccRCC中有39个呈现表达差异,其中24个基因表达上调,15个基因表达下调。差异表达基因的功能注释结果显示它们与各类RNA的甲基化修饰和物质代谢有关。2、39个差异表达基因的单因素cox分析显示有12个因子与ccRCC的预后有关(P<0.05),以这些因子的表达数据为基础,可以将TCGA数据库中的ccRCC患者聚类为1和2两种分子类型。卡曼(Kaplan-Meier,K-M)生存分析显示2型患者的生存预后明显差于1型患者;富集分析结果显示2型分子分型主要与物质代谢有关,2型患者的免疫评分明显高于1型(P<0.05),2型中CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSC),单核细胞等免疫细胞的浸润程度明显高于1型(P<0.01)。3、将12个预后因子纳入Lasso cox中分析,获得一个7基因风险评分模型:Risk Score=0.571*NOP2+0.393*NSUN6-0.313*TRMT61B-0.049*ALKBH1+0.185*NSUN5-0.343*TET2+0.02 6*DNMT3B。7个基因中,4个为危险因子(NOP2、NSUN6、NSUN5、DNMT3B),与ccRCC的不良预后有关;3个为保护因子(TET2、TRMT61B、ALKBH1),与相对好的预后有关。利用风险评分进行分组,然后进行K-M分析,低评分组患者的生存时间明显长于高评分组患者(P<0.001);单因素和多因素cox分析结果显示:风险评分、年龄、分期和分级是ccRCC的独立预后因素(P<0.05)。利用这些独立预后因子,构建出一个预测ccRCC 1年、3年和5年生存率的列线图。4、基于多因素cox分析和文献检索将风险评分模型中的构成因子NOP2确定为进一步实验验证的关键基因。5、ccRCC细胞株中NOP2 mRNA(P=0.0271)和蛋白质(P=0.0129)的相对表达量均高于正常肾小管上皮细胞株。6、NOP2 mRNA在ccRCC新鲜组织(P=0.0082)中较正常肾组织显著上调。免疫荧光实验显示NOP2蛋白在ccRCC中的表达模式主要为核阳性染色,在正常肾组织中的表达模式主要为细胞质或细胞膜阳性染色,而少见核阳性表达。免疫组化中NOP2蛋白的表达模式和定位与免疫荧光相同。结合文献以核阳性率作为NOP2蛋白表达情况的评价指标,ccRCC组织中的NOP2核阳性率为42.9±15.7%,癌旁肾组织中的核阳性率为14.1±13.5%,统计结果表明ccRCC癌组织中的NOP2蛋白表达量明显高于正常肾组织(P<0.001)。7、以核阳性率的中位数43.67%作为截断值将患者分为NOP2蛋白高表达组和NOP2蛋白低表达组,统计结果显示高NOP2蛋白表达组与ccRCC高肿瘤分级(3级和4级,P<0.001)和高Ki-67指数(P=0.0035)有关,但年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、肿瘤分期、有无癌栓和性别等参数在不同NOP2蛋白表达组间未获得统计学差异。8、NOP2蛋白表达与ccRCC患者的总生存时间(Overall Survival,OS,P=0.0015)和无进展生存时间有关(Progression-Free Survival,PFS,P<0.001),NOP2蛋白表达高表达组的OS和PFS差于低表达组。对NOP2蛋白表达及其它临床病理参数进行单因素和多因素cox分析,在单因素分析中NOP2蛋白表达(P=0.0072)和肿瘤分级(P=0.015)与患者的OS相关;多因素cox分析中NOP2蛋白表达(P=0.041)与患者OS有关,是ccRCC的独立预后因素。最后以NOP2蛋白表达等参数为基础,可以构建预测ccRCC患者生存率的列线图模型。【结论】1、ccRCC中存在多个差异表达的RNA甲基化调控因子,且与该病的预后相关。2、基于预后相关的RNA甲基化调控差异表达因子可以将ccRCC患者分为1型和2型,2型患者的预后差于1型,这种差异形成的原因可能与2型患者中代谢功能紊乱引起的免疫抑制有关。3、通过机器学习模型构建的7基因风险评分模型对ccRCC有较强的预后评估能力,并且风险评分、年龄、分期、分级是ccRCC的独立预后因素,这些因素联合建立的列线图可以实现预后能力的量化。4、RNA甲基化调节关键因子NOP2的mRNA和蛋白表达在ccRCC组织和细胞系中均显著上调,并且NOP2mRNA和蛋白的高表达均与ccRCC患者的不良预后有关。5、NOP2蛋白表达是ccRCC的独立预后因素,可能参与该肿瘤的疾病进展,在ccRCC中发挥促癌作用。