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苯甲脒琼脂糖凝胶4FF使用 说明

更新时间:2021-01-28      浏览次数:615

苯甲脒琼脂糖凝胶4FF使用 说明

 

苯甲脒类物质是丝氨酸蛋白酶的广谱抑制剂,所以将这类物质偶联到琼脂糖凝胶4FF上,可以从各种来源的样品中一步纯化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽释放酶、前激肽释放酶等丝氨酸蛋白酶。

 

苯甲脒-琼脂糖凝胶 4FF 对于不同的样品的亲和力不同,吸附载量取决于流速、pH、缓冲液组成和温度等参数。

 

1)让所有的材料和试剂达到室温。配制初始缓冲液(平衡液)和洗脱缓冲液。

2)根据柱子大小取所需量的凝胶,用去离子水清洗掉 20%乙醇,用初始缓冲液(按凝胶:缓冲液=31 的比例)配成匀浆。

3)将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位,务必使底端无气泡。

4)用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内,注意勿使产生气泡。打开柱子出液口,使凝胶在柱内自由沉降,连结好柱子顶端柱头。

5)打开蠕动泵,让缓冲液用使用时流速的 1.33 倍的流速流过,使柱床稳定(注意压力不要超过填

 

样品应*溶解,并且pH值应与结合缓冲液pH值相同。

为了避免堵塞层析柱,我们建议通过0.45μ m过滤器进行离心和过滤,以去除细胞碎片或其他颗粒物质

 

平衡色谱柱

5-10个柱体积的结合缓冲液平衡该柱,直到流出液电导和pH不变。 参考结合缓冲液:0.05M Tris-HCl0.5M NaClpH 7.4

上样

1)样品用平衡液配制,样品一定要离心或过滤后上样。盐浓度太大的样品需要处理后再配。

2)一般情况是让目标产品结合在柱子上,用平衡液洗去杂质和没有结合的蛋白,再选择一种洗脱洗下目标产品

 

洗脱

洗脱条件因样品而异,具体参考文献。

参考洗脱缓冲液:0.05M甘氨酸,pH 3.010mM HCl0.5M NaClpH2.0,可以往收集到的洗脱液中加入pH9 1M Tris-HCl,这将防止洗脱蛋白质由于pH低而变性。

结合物可以特异性或非特异性地洗脱。在结合缓冲液中加入20mM对氨基苯甲脒,使用竞争剂为目标分子,抑制剂对氨基苯甲脒来洗脱特异性结合的物质。

再生

根据样品的性质,可以通过用2-3床体积的高pH0.1M Tris-HCl + 0.5M NaClpH8.5)和低pH值(0.1M 乙酸钠+ 0.5M NaClpH 4.5)缓冲液交替洗涤填料,来再生苯甲脒-琼脂糖凝胶 6B,该循环应重复3次,然后用5-10倍柱床体积的结合缓冲液重新平衡。 

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