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醋酸纤维素薄膜电泳实验会遇到的问题

更新时间:2020-12-23      浏览次数:3638

醋酸纤维素薄膜电泳实验会遇到的问题

 

1. 电泳图谱不齐或分离不良
这是电泳分析中常见的问题,多数是由于血清滴加不均匀或滴加过多,也有因薄膜质量不合要求所致。点样这一步非常关键,一定要按操作步骤进行。首先选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。然后将滤纸吸去薄膜表面的多余水份,使薄膜含水量饱和均匀,这样才能防止薄膜表面液体含量不均,水份移动而引起标本移位。

点样前注意关闭门窗和风扇,因空气流通快可使标本和水份蒸发而影响电泳图形。点样要力求做到均匀迅速,有报道,在实践中把加样器干沾血清,改为沾取标本前先浸入蒸馏水中沾湿用吸水纸吸干后再沾血清,这样加样器内均匀沾取血清的效果较干沾为佳。
2. 电泳图谱出现条痕
问题是由于点样后薄膜过干,或因电泳槽密闭性不良,或电流过大,温度升高,薄膜水份蒸发干燥而造成的。因此薄膜一定要充分浸透后才能点样,并注意检查电泳槽是否盖紧,电泳槽要放在远离光源热源的阴凉之处。

在电泳过程中随时观察电压电流的变化,因通电后产生一定的热量,电流会有所增加。控制电压100~110 V,电流0.5~0.6 mA/cm,电泳时间一般冬长夏短,以区带展开3.5~4 cm 即可(另加一条溴酚蓝预染血清,同样操作,指示区带展开的距离)。
3. 区带拖尾或区带过于紧密
缓冲液的离子强度低于0.05即出现区带拖尾现象,离子强度>0.075则区带过于紧密。此时需要检查更换缓冲液。常规操作一般使用连续电泳盐缓冲液pH8.6,离子强度0.06。电泳槽中缓冲液经10次使用后,不应简单地采取交换电极的方法,而是将缓冲液取出重新混合过滤后,再进行使用,一般用4个周期后需更换新液。

4. 区带一边长一边短呈现扭曲现象
这是薄膜两边电阻不一样,电阻大的一边电流小,速度慢,区带展开短。造成这种现象的原因是薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上,使薄膜接触不良而增大了电阻。在操作过程中,一定要注意使薄膜两端紧压在滤纸桥上。
5. γ球蛋白区带倒退
这是电渗作用引起的。可升高点样端的缓冲液面高度或适当加大电流量克服之。
6. 染色后白蛋白中间色浅
有些同学在实验中往往急于求成,染色时间未到便匆忙取出薄膜漂洗,结果造成了白蛋白区带中间色浅的现象。造成这种现象的另一个原因是白蛋白含量过高。可增加染色时间或减少点样量解决之。
7. 染色后区带清晰度不良
陈旧标本可使区带分离清晰度大为降低。应尽量当日标本当日做,不超过2天。另外标本不可溶血,因溶血标本中血红蛋白与β球蛋白的电泳区带相重迭。可造成β球蛋白含量升高而蛋白质含量相对减少的结果。
8. 白蛋白区带染色不均并有空泡
这是染色液陈旧所致,染色液存放和使用过久,会降低蛋白质结合染料的能力。发现正在使用的染液已陈旧时,应立即全部弃去,更换新液。
9. 透明时膜发白不能*透明
薄膜未干或透明液中醋酸含量不足可造成膜发白而不能达到透明的目的,应将薄膜晾干,适当增加透明液的醋酸浓度。
10. 透明时膜溶解
室内温度过高或透明液醋酸浓度过高均可使膜溶解。可采用适当降低透明液醋酸浓度的办法来解决。

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