EZfusion 同源重组酶一站式解决所有问题。

EZfusion 同源重组酶一站式解决所有问题。

EZfusion Enzyme 专门为把 PCR 产物快速、定向、有效的克隆到任何目标载体而设计。有效的避免了在克隆过程中遇到的合适内切酶的选择、磷酸化、补平、加 A、使用中间载体等等一系列复杂步骤。无需连接酶，只需要把目标载体线性化(平末端，粘性末端都可以)，PCR 产物无需任何酶促处理，直接和目标载体混合，20-30 分钟一站式解决所有问题。

技术原理：根据酶切后线性化载体的两端序列，分别在目的基因两端设计 15 base
与载体末端同源的序列，PCR 扩增产物两端就会分别带有 15bp 与线性化载体两端相
同的序列。PCR 产物和线性化载体与 Ezfusion Enzyme 酶充分混匀。22℃温浴 30min
后，按传统方法转化 E.coli competent cells,就可以高效、定向地将 PCR 产物克隆到目标载体上。
 

操作步骤：
A. PCR 引引物设计及段准备 物设计及片段准备用该试剂盒克隆目的基因或者目标 DNA 段到的线性化载体，PCR 扩增的引物外侧必须有 10-18 个碱基与线性载体外侧*配对。现就 15 个碱基配对举例

注意：公司的引物设计与 BD in-fusion kits 是不同的，使ÿ用ÿ公司的试剂仅使用上游10-18 个碱基和下游 10-18 个碱基作为附加碱基即可。可以采用任何聚合酶来得到 PCR 产物，但是，引物和引物二聚体会对 Ezfusio 有一定的抑制作用。如果 PCR 反应得到单一的目的条带，PCR 产物可以用 PCR 纯化试剂盒回收 ； 如果 PCR 产生很多非特异性条带，应该用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒去掉多余 条带。

适用范围：

（1） multiple fragments cloning and assembly. 
（2） cloning of any insert into any location of a chosen vector. 
（3） complete elimination of the dependence on availability of restrictionsites, phosphatase treatment and ligation. 
（4） inserts free from any redundant or unwanted base pairs. 
（5） save over 50% on reagent costs in comparison to other productsavailable on the market. 

B. 线性化载体的制备
载体的*线性化对于重组实验至关重要，没有线性化的载体会产生非常高的背景。 线性化后的载体需要过柱纯化或者凝胶回收纯化。

C. 同源重组反应的建立

D. 转化
1. 新鲜制备的或-70℃下保存的 100ul 感受态细胞，置于冰上，*解冻后轻轻地
将细胞均匀悬浮。
2. 加入 10-12ul 连接液，轻轻混匀，冰上放置 30 分钟。
3. 42℃水浴 90 秒，冰上放置 2 分钟。
4. 加 600ul SOC 培养基，37℃ 250rpm 振荡培养 1 小时。
5. 室温下 4000rpm 离心 5 分钟，用吸头吸掉 500ul 上清液，用剩余的培养基将细
胞悬浮。
6. 将细菌均匀细致的涂布在 90mm 平板上。
注：细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感受率而进行适当调整。
7. 平板在 37℃下正向放置 1 小时后以吸附过多的液体，然后倒置培养过夜。