腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶

测定意义

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。

测定原理

AGP催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存;

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1支，4℃保存；临用前加入250μL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入2mL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍4℃保存；

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍4℃保存；

试剂五：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入3mL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入250μL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存；

试剂七：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入250μL双蒸水充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存；

粗酶液制备

称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤（在1.5mL EP管中依次加入下列试剂）：

混匀，30℃保温15 min，置沸水浴中1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴迅速冷却

混匀后立即在340 nm波长下记录初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

AGP活性计算

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。

AGP活性（U/mg prot）＝反应总体积（700μL ）÷样本体积（20μL ）÷反应时间(2min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）=2813×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）。

此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

AGP活性（U/g 鲜重）=反应总体积（700μL ）÷样本体积（20μL ）÷反应时间(2min)÷NADPH消光系数（6.22×10^-3）×ΔA ÷样本鲜重(g/mL) =2813×ΔA÷样本鲜重(g/mL)