庆祝我司合作客户成功发表关于肺鳞癌研究的文献

标题：《THOC3转运PFKFB4 mRNA促进肺鳞癌发展的机制研究》

摘要：背景与目的: 在肺恶性肿瘤中,肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)所占的比例约占30%,然而其临床治疗效果尚不理想。目前仍缺乏针对肺鳞癌的有效靶点,免疫疗法对其的控制作用有限,化疗和抗血管治疗的毒副作用和耐药性不容忽视。因此,明确促进肺鳞癌发展的关键分子和调控途径及相关机制具有重要的临床转化价值。 核转运蛋白是负责调控m RNA(messenger RNA,信使RNA)进出细胞核一组重要分子,在肿瘤发生发展中起重要作用。THO复合物(THO Complex,THOC)是核转运相关蛋白TREX(transcription-export,转录/输出复合物)的重要组分,参与调控m RNA的转录和输出过程。本文主要目的是研究THOC3在肺鳞状细胞癌中的表达水平对肿瘤生长进展的影响,初步探讨肺鳞癌中THOC3转运m RNA调控下游的促癌机制,探索THOC3作为核转运蛋白的在调控转录本稳定性方面的功能,为进一步深入阐述THOC3基因介导肺鳞状细胞癌进展的分子调控机制奠定理论基础,有助于为肺鳞癌靶向治疗提供新的理论依据。 方法: 1.利用肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)、基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)和基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)数据库研究肺鳞癌与癌旁组织中THOC3的表达情况;利用Kaplan-Meier(KM)绘图仪公共数据库绘制肺鳞癌患者中THOC3不同表达组的总体生存曲线。 2.收集90对肺鳞癌患者癌及癌旁组织,并通过免疫组化(immunohistochemistry,IHC)、实时荧光定聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction,q PCR)和免疫蛋白印迹实验(western blot,WB)检测THOC3的表达;通过q PCR实验和WB实验,检测人原代支气管上皮BEAS-2B(B2B)细胞和3株肺鳞癌细胞系(H1703,H520和SKMES1)中THOC3的表达;运用免疫荧光(immunofluoresence,IF)细胞染色法检测THOC3在细胞核质中的定位状况。 3.使用RNA干扰(RNA interferience,RNAi)技术抑制肺鳞癌细胞中内源性THOC3表达,筛选稳定低表达的细胞系,建立亚细胞系。体内外检测THOC3对增殖、迁移、侵袭和成瘤的影响:通过细胞计数(cell counting kit-8,CCK8)实验和细胞克隆实验观察THOC3对肺鳞癌细胞增殖的影响,细胞损伤修复实验和Transwell实验观察THOC3对肺鳞癌细胞的迁移和侵袭能力的影响;BALB/c裸鼠成瘤实验验证THOC3对肺鳞癌细胞成瘤能力的影响。 4.对正常或敲低THOC3的肺鳞癌细胞进行转录组测序,京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes,KEGG)通路富集和基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)差异表达的基因;q PCR和WB实验检测糖酵解通路相关基因PFKFB4在肺鳞癌中的表达。利用RNAi和质粒转染技术完成回复实验,构建沉默和过表达PFKFB4的sh THOC3细胞系;通过体内外细胞功能实验、细胞凋亡和糖酵解相关代谢水平的检验分析,进一步检测THOC3转运PFKFB4 m RNA对肺鳞癌发展的影响。 5.IF和qPCR检测敲低THOC3对PFKFB4 mRNA核质分布的影响,通过质谱(mass spectrum,MS)鉴定和基因本体功能(Gene Ontology,GO)分析查找THOC3互作蛋白,免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,CO-IP)和IF检测THOC3和YBX1的结合,转录组测序检测二者共调控基因,q PCR、WB实验检测THOC3或YBX1敲除后PFKFB4的表达水平。利用RNA-蛋白结合预测数据库cat RAPID探索THOC3与下游m RNA可能的结合位点,完善RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)、RNA下拉实验(RNA pull down)检测敲低THOC3或YBX1后下游PFKFB4 m RNA的稳定性改变。 结果: 1.TCGA研究结果显示,THOC3在肺鳞癌中的表达高于癌旁组织,KM分析显示,THOC3高表达患者的预后较差。 2.THOC3在肺鳞癌临床样本中的表达高于癌旁样本,THOC3主要富集于肺鳞癌细胞质中,在肺鳞癌细胞中的表达显著高于正常肺上皮细胞。 3.在肺鳞癌细胞系成功构建低表达THOC3的亚细胞系,经体外实验结果显示,THOC3敲低后可抑制肺鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,经体内实验结果显示,THOC3敲低后抑制肺鳞癌在裸鼠体内成瘤。 4.THOC3低表达的肺鳞癌细胞,下游糖酵解通路受到抑制,代谢相关基因PFKFB4的表达也随之下降,导致肺鳞癌细胞糖酵解水平降低,影响细胞代谢从而影响肺鳞癌细胞增殖、转移等多种生物学行为,继而诱发细胞凋亡。 5.IF、RIP和RNA下拉实验证实了THOC3和PFKFB4 mRNA的相互结合,结合位点位于PFKFB4 m RNA的3′UTR端。质谱鉴定了THOC3的互作蛋白是RNA结合蛋白YBX1,CO-IP和IF实验证实了二者的结合互作。YBX1是m5C修饰阅读器,PFKFB4 m RNA的3′UTR端有m5C修饰,THOC3与YBX1结合,识别PFKFB4 3′UTR端的m5C修饰从而稳定转运m RNA至细胞质发挥促癌作用。 结论: 1.THOC3的表达水平可能与肺鳞状细胞癌患者的生存预后有密切联系;THOC3有一定潜力可作为肺鳞癌诊断与评估临床预后的肿瘤标志物。 2.THOC3促进肺鳞状细胞癌的恶性进展,THOC3可以结合下游糖酵解相关基因PFKFB4 m RNA,将其从胞核转运至胞质,促进细胞糖酵解影响细胞代谢,抑制细胞凋亡,进而促进肺鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。 3.THOC3与PFKFB4 mRNA的结合区域3′UTR端存在m5C修饰,THOC3可以和m5C阅读器YBX1结合,通过识别m5C位点调控PFKFB4转录本出核过程。调控mRNA的稳定性。