恭喜我司合作客户成功发布关于急性病毒性心肌炎的文献

标题：《急性病毒性心肌炎小鼠模型中lncRNAs的表达谱分析及lncGBP9作用机制的初步研究》

摘要：背景及目的:柯萨奇B3病毒(coxsackievirus B3,CVB3)是导致急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis,AVMC)的主要病原体,可导致暴发性心肌炎、恶性心律失常或心脏骤停,其致病机制主要涉及病毒的直接感染、自身免疫反应和代谢紊乱等。随着技术的进步,现在可以更快更准确地诊断AVMC,但AVMC的治疗仍主要局限于抗病毒、免疫调节及循环支持治疗。因此,迫切需要提升我们对AVMC发生发展机制的理解,这可能为开发新的治疗方法提供线索。 长链非编码RNAs(long noncodingRNAs,lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸且缺乏蛋白质编码能力的转录本,其重要的调控功能正受到研究工作者的广泛关注。近10年来,越来越多的证据表明lncRNAs在不同的细胞过程中发挥着关键的作用,如细胞发育、分化、增殖、炎症和凋亡等。LncRNAs在各种心血管疾病中的关键作用也被逐步挖掘,然而很少有研究探讨lncRNAs在AVMC中的表达及作用机制。 鉴于此,本课题组首次应用高通量测序分析AVMC小鼠心肌组织中lncRNAs的差异表达谱,并进行生物信息学研究。另外,我们推测lncRNA鸟苷酸结合蛋白9(lncRNA guanylate-binding protein 9,lncGBP9)在AVMC中可能发挥重要作用,从体内和体外层面评估lncGBP9在AVMC中的生物学功能,并进一步探讨其潜在机制。本研究从一个崭新的角度理解AVMC的致病机制,为今后寻找可能的治疗靶点提供新思路。 方法: 1.基于高通量测序的AVMC小鼠心肌组织中lncRNAs的表达谱分析及生物信息学研究:首先通过腹腔注射CVB3构建AVMC小鼠模型,选择5对心肌组织样本(Control组和AVMC组各5个)进行高通量测序,对比分析lncRNAs和信使RNAs(messengerRNAs,mRNAs)的特征,筛选出差异表达的lncRNAs(differentially expressed lncRNAs,DElncRNAs)和mRNAs(differentially expressed mRNAs,DEmRNAs),并进行GO分析及KEGG分析。接着,应用RT-qPCR验证测序结果的可靠性。最后,通过构建DElncRNAs和DEmRNAs的共表达网络进一步研究DElncRNAs在AVMC中的调控机制。 2.LncGBP9在小鼠AVMC中的作用及机制研究:选择明显高表达的lncGBP9进行研究。MEM及lncLocator网站预测lncGBP9的作用、富集通路及定位,RT-qPCR检测其在AVMC小鼠心肌组织中的表达情况,FISH分析其亚细胞定位。构建敲低lncGBP9的重组9型腺相关病毒载体,利用心脏超声、心肌冰冻切片、HE染色、TUNEL染色、RT-qPCR及WB等方法研究敲低lncGBP9对AVMC小鼠心功能、心肌炎症及凋亡的影响。RT-qPCR及ELISA检测促炎细胞因子(TNF-α,IL-6,IL-1β)的表达,并分析敲低lncGBP9对NF-κB信号通路的调控作用。 3.LncGBP9在感染CVB3的HL-1心肌细胞中的作用及机制研究:体外培养HL-1心肌细胞,利用敲低lncGBP9的慢病毒载体,构建稳定敲低lncGBP9的HL-1细胞株。通过CCK-8、流式细胞术、RT-qPCR、WB、ELISA等方法评估lncGBP9敲低对感染CVB3的HL-1细胞的存活力、炎症及凋亡的影响。最后,WB实验进一步检测NF-κB信号通路中关键蛋白的磷酸化水平。 结果: 1.成功构建AVMC小鼠模型,测序结果分析显示,与mRNAs对比,lncRNAs的转录本和开放阅读框的长度较短,且具有较少的外显子数量。以padj<0.05和|log2Fold Change|>1为阈值,共筛选出1122个DElncRNAs和3186个DEmRNAs,包括734个上调和388个下调的lncRNAs、1821个上调和1365个下调的mRNAs。GO和KEGG分析显示上调的mRNAs主要参与免疫相关过程,下调的mRNAs主要参与代谢相关过程,DElncRNAs的共定位和共表达基因也主要参与代谢及免疫相关过程。RT-qPCR分析验证了随机选取的12个基因(6个DElncRNAs和6个DEmRNAs)的表达水平与测序中的表达水平一致,反映了测序结果的可靠性。最后,使用Cytoscape构建在细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、MAPK信号通路及PI3K-Akt信号通路中DElncRNAs和DEmRNAs的共表达网络(|PCC|>0.99),分别包含了65个DElncRNAs与38个DEmRNAs、21个DElncRNAs与16个DEmRNAs及31个DElncRNAs与17个DEmRNAs。 2.MEM网站预测结果显示,lncGBP9的共表达基因在“Viral myocarditis"和“NF-κB signaling pathway"均显著富集;lncLocator网站预测其可能主要富集于细胞质中。RT-qPCR及FISH实验证实其在AVMC小鼠心肌组织中的明显高表达并且主要定位于细胞质。敲低lncGBP9有助于减轻AVMC小鼠的心肌炎症及凋亡,进而改善心功能。此外,敲低lncGBP9还可以抑制NF-κB信号通路激活,从而减少体内促炎细胞因子(TNF-α,IL-6,IL-1β)的产生。 3.RT-qPCR证实lncGBP9在感染CVB3的HL-1心肌细胞中明显高表达。敲低lncGBP9可以通过调控NF-κB信号通路提升感染CVB3的HL-1细胞的存活力、抑制细胞凋亡、减少促炎细胞因子(TNF-α,IL-6,IL-1β)的释放。 结论: 1.本研究鉴定了AVMC小鼠心肌组织中lncRNAs和mRNAs的差异表达谱。生物信息学研究表明,这些DElncRNAs、DEmRNAs及其相互作用可能在AVMC发生发展中发挥关键作用,为阐明AVMC的致病机制提供了宝贵的信息。值得注意的是,我们证实部分DElncRNAs参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用、MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路的调控,未来值得进一步深入研究。 2.本研究还揭示了敲低lncGBP9对CVB3诱导的AVMC的保护作用,其可通过减轻心肌的炎症损伤和细胞凋亡,从而改善心功能,这可能部分归因于NF-κB信号通路的抑制,进而减少相关促炎细胞因子的产生。因此,lncGBP9可能是AVMC治疗的一种新的、潜在的靶点。