CCK试剂盒实验中的小技巧，你学会了吗

 Cell Counting Kit简称 CCK 试剂盒，为MTT法的替代方法，是一种基于WST（水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。 

细胞活性检测 

1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在37℃,5% CO2的条件下）。 

2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 

4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 

5、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。 

细胞增值-毒性检测 

1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37℃，5% CO2的条件下）。 

2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质。 

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。 

4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。 

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 

7、如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。 

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 

实验小技巧：

①建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK试剂后的培养时间。 

②有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔减的差异。加入CCK试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基页面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。 

③白细胞可能需要培养较长时间。 

④当使用标准96孔板时，贴壁细胞的小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK溶液。 

CCK试剂盒实验中的小技巧，你学会了吗