1,5-二磷酸核酮糖化酶(Rubisco)试剂盒的正确使用方法

 1,5-二磷酸核酮糖化酶(Rubisco)试剂盒的正确使用方法

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（ribulose-1，5-bisphosphale carboxylase，RuBPCase）是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，是植物中最丰富的蛋白质，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量约占叶绿体可溶蛋白50%~60%。本实验分别用分光光度法和同位素法测定酶的羧化能力。

二磷酸核酮糖叛化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着 CO2的固定，同时又制约着碳素向 Calvin 循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。测定原理;在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1,5-二磷酸RuBP)与1分子的 CO, 结合，产生 2分子的 3-磷酸甘油酸(PGA)，PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶I(NADH)氧化。因此，340nm 吸光度的变化可计算还原型辅酶 I氧化速率，还原型辅酶I氧化速率可反映 Rubisco 的活性。

自备的仪器和用品:

可见-紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、lmL 石英比色皿、研钵、冰、蒸馆水。

四、试剂的组成和配制:

提取液一: 液体 25mLx1 瓶，4C保存:提取液二:液体 25mLx1 瓶，4C保存:

试剂一: 30mLx1 瓶，4C保存:

试剂二: 粉剂x1 瓶，-20C保存，临用前加入 12.5mL 试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融:试剂三:粉剂x1 瓶，-20C保存，临用前加入 12.5mL 试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融:试剂四: 粉剂x1 瓶，-20C保存，临用前加入 1.25mL 试剂一，充分混备用，用不完的试剂分装后-20保存，禁止反复冻融;(注意: 试剂二、三、四济解后，按需分装-20C保存。)

五、样本本处理:

1、总 Rubisco 酶提取:建议称取约 0.1g 样本，加入mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎 (冰浴，200W.

破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min)，然后4C，8000g 离心 10min，取上清测定。

胞浆和叶体 Rubisco 的分离: 按照物组织质量(g): 提取液体积(mL)为 1:5-10 的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL 提取液一)，冰浴匀浆后于 4C，200g 离心5min，分离并保留沉淀，取上清在4C，8000g 下离心 10min，取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性: 取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎(冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间1min)，然后4C，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中 Rubisco 酶活性。

建议测定总 Rubisco 活性，按照步1提取液，要分别测定胞和叶绿体中的 Rubisco，则按照步骤2 提取粗液。 (注意:粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。)

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