Western blotting ECL化学发光法检测试剂盒

产品简介：

SDS-PAGE电泳后，蛋白质按照分子量大小分离，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，加入发光底物后，能让胶片感光。经显影和定影后，可以在胶片上显示出条带（抗原所在位置）。

操作步骤：(仅供参考)

常规电泳转膜后:

1) 清洗转印膜：将膜剥离下后，作好标记，一般在左上角剪一缺口。室温用TBS-T 漂洗3 次每次5min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。

2) 按5g 封闭试剂加100ml 双蒸水计，配制膜封闭液，配好的膜封闭液为乳白色悬液，将漂洗过的转印膜放入封闭液内，置摇床孵育，室温封闭30min。用TBS-T 缓冲液（PH7.6）洗膜，室温漂洗3 次每次5min。

3) 将10×抗体稀释液用双蒸水稀释成1×（10ml 10×抗体稀释液加入90ml 双蒸水，混匀，可4℃保存三个月）。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。

4) 用1×的抗体稀释液稀释一抗。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜放入杂交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育过夜或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步将膜沿电泳方向剪成条，分别作好标记，分开孵育。

5) 用TBS-T 缓冲液（PH7.6）洗膜，室温漂洗3 次每次5min。

6) 用1×的抗体稀释液稀释二抗。根据用量，按10ml 抗体稀释液加入15ul HRP 标记二抗的比例，配制二抗工作液。将杂交膜放入杂交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃摇动孵育1h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。

7) 用TBS-T 缓冲液（PH7.6）洗膜，室温漂洗3 次每次10min。

8) 根据用量，取ECL 发光液A、B 等量混匀，加在膜正面，暗室显色1-5 分种。倾去显色液，小心用纸吸去显色液，在上面盖一层平整的透明纸。再取出感光胶片，做好标记，轻轻的放在膜上，显色30 秒到1 分钟，取出胶片浸入显影液中，观察显色情况，再放入定影液中1 分钟。根据条带强弱，再次感光时可减短或者加长感光时间（从5 秒到30 分钟）以期达到理想结果。

注意事项：

1. 请根据一抗来源选择试剂盒。

2. 可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深，可延长膜封闭时间，加长最终漂洗次数与时间。如果条带过弱，可增加抗体浓度，可延长抗体孵育时间或加长感光时间。

3. TBS-T（0.01M，PH7.6）配制方法：称取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml 的双蒸水溶解，用盐酸调PH 到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用双蒸水 加至1000ml，混匀即可。（也可按照自己的配制习惯来配制）